ONT全长转录组十问十答

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近些年，随着转录组测序技术的推广和普及，大家对测序技术本身的要求越来越高了，三代测序技术从最初的蛰伏到现在的高歌猛进，在解决转录本精确定量和“仿真”的结构分析方面确实是有质的飞跃，这技术平台的一小步，在科研圈是实打实的一大步。
ONT全长转录组的碱基质量，读长情况，比对率，转录本鉴定到底如何，我们根据真实项目的数据来看看。各个物种测序数据量从2G到10G不等，N50都在0.9Kb-1.5Kb，属于正常范围，质量值平均达到Q10，全长率基本在80%左右，与参考基因组的比对率基本在90%左右。
很多老师跃跃欲试，又有各种问题想要咨询。今天小编给大家整理了十个典型问题，一起来看看吧！
Q
1. ONT全长转录组以“全长”为特点，为什么还有N50这个指标呢？
A
答：N50只是对长度的一个评估指标，只是一种评估方式。N50指的就是将序列从长到短排序，将他们的长度相加，长度正好为总长度的50%时的那条序列的长度。我们认为N50越长，总体转录本长度越长。

Q
2.目标品种的基因组已公布，但这个基因组序列质量没有通用的模式品种基因组质量高，我该选择哪个基因组？
A
答：推荐尽量使用与测序数据相同品种的参考基因组进行分析。

Q
3.除了可以区分不同转录本，全长转录组还有什么其他优点？
A
答：与二代相比，ONT全长转录组不仅可以鉴定可变剪接类型，同时还能将不同剪接类型的全长转录本呈现出来，这是二代所不能比拟的，其在可变剪接、融合基因等结构分析鉴定，更为精确和丰富。二代测序的reads短，会导致转录本的定量不准确，而Nanopore数据因为序列长，转录本的定量就会更准确。

ONT检测到拟南芥复杂转录本
(Parker M T  et al. Elife Sciences, 2020)

Q
4.原核生物没有可变剪切，还有没有必要做全长转录组？
A
答：目前三代的建库方式都是调取polyA的，所以暂不支持原核物种的测序。

Q
5.一个样品需要建几个文库？
A
答：一个样品只建一个文库，需要设置生物学重复，一般3个重复。

Q
6.nanopore的错误率太高，会不会对结果有影响？
A
答：Nanopore下机数据准确率为目前已经可以到90%，即碱基平均错误率为10^(-1)=10%左右。但这是单碱基错误率，后续分析时我们还会对数据进行矫正。我们在比对时用的是全长序列和参考基因组或参考转录组进行比对，序列越长比对时对于碱基错配度容忍越高，因此不会出现错误比对或对表达定量有影响。

Q
7.可变剪切结果是否也要结合表达数据？
A
答：可变剪切是从结构上分析基因的一个变化情况，表达量是分析不同可变剪切体的具体表达，二者结合去分析，可以将问题分析的更透彻。

Q
8.为什么ONT全长转录组测序数据量推荐2G，而二代转录组推荐6G？
A
答：ONT全长转录组测序一条reads即代表该转录本表达一次，而二代短reads需要非常多条才能覆盖一个转录本；Oxford Nanopore公司官方白皮书中数据显示：当相同数量的基因被覆盖达95%时，ONT所需要的reads数比Illumina约少50倍，所需要碱基数约少7倍，故而2G ONT数据能达到6G Illumina检测效果；针对同一样本进行的饱和度分析显示，2G ONT全长除表达量极低的（CPM<1）其他转录本都达到饱和了，二代Illumina 6G除表达量极低FPKM<1外的基因检测也饱和了，且前者更早趋向饱和；目前已发表的人鼠文献中ONT全长测序的数据量也不到2G 。

转录本覆盖度比较（Nanopore官方白皮书）

不同表达量转录本的饱和度

Q
9.全长转录组能准确测出poly结构的序列吗？
A
答：目前全长测序，通过读取polyA序列而识别哪里是APA位点，但是对于现有的分析流程，无法把polyA的长度（即A的位点个数）鉴定出来。

Q
10.为什么 PB 不能做定量，ONT 可以做定量？
A
答：PB 也是可以做定量的，但是由于芯片中 ZMW 孔数限制，需要较大的数量才能达到饱和，成本比较高，目前常用二代来辅助定量。而ONT 可以在较低数据量测到饱和，比较适合做转录本和基因的定量。
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