工业生物催化过程的发展及其展望
杜晨宇1 李 春1 张 木2 曹竹安1
（1．清华大学化工系生化所 北京 100084 2. 中国生物工程开发中心 北京 100081）
摘 要：本文综述了近年来工业生物催化过程的发展，提出按照生物催化剂的制备和催
化过程的特点，将工业生物催化分成生长耦联型催化和生长非耦联型催化，通过这两类
生物催化成功的范例以及研究进展，讨论生物催化工业化的途径和方法，以及进一步发
展的方向和对策。
关键词：生物催化剂，催化过程，生长耦联型，生长非耦联型
自生物技术诞生之日，人们就一直致力于把它应用到工业生产当中。工业生物催化是生
物技术应用中一个新兴和关键的领域。生物催化技术首先从和它联系最紧密的医药、农
业开始，逐渐涉及到化工、材料等行业，并通过它们，影响社会生产、生活的各个方面。
美国21世纪发展规划中预计，到2020年，通过生物催化技术，将实现降低化学工业的原
料消耗、水资源消耗、能量消耗30％，减少污染物的排放和污染扩散30％[1]。
1. 工业生物催化的发展
催化剂在化学工业中占有重要的地位。以催化作用为基础的化学合成品占化工产品的60％
，其技术渗入量占目前化工生产技术的90％。而生物催化剂恰恰是由生物合成的具有催
化作用的物质。现阶段工业上应用的生物催化剂包括生物体（微生物）和酶类。由于生
物催化剂的高效性和高选择性，它在化学工业上的应用已经具有越来越大的吸引力。它
们易于催化得到相对较纯的产品，因此可减少废物排放且可以完成传统化学过程所不能
胜任的位点专一性、化学专一性和立体专一性催化。
生物催化过程对于化学催化过程而言，具有高效和高选择性的催化效率，并在一些化学
合成领域有着传统的催化剂不可比拟的优势[2]。生物催化技术极大的促进了生产力的
发展，它既是一种可以持续发展的技术，又是一种环境友好技术。社会对新技术、新产
品的渴求，包括医药产品（尤
其是生产手性药物）、医疗诊断仪器设备、新兴生活用品、低脂肪食品等等，也要求生
物催化技术更快更好的发展。随着公众环保意识、可持续发展意识、健康意识的加强，
人们在商品取向上也会更倾向使用生物制品和新型环保产品。现在许多国家正致力于酶
工程的研究，逐步实现酶的工业化应用。生物技术与医药、农业结合极大地推动了这两
个领域的发展，随着生物技术与化学工业结合的日益紧密，生物技术的第三次浪潮即将
到来。
2. 工业生物催化反应的类型
历经二十多年的发展，酶的工业应用已取得了令人瞩目的成就。采用高效、高选择性的
酶作为工业催化剂，开发环境友好的工艺来生产医药化工产品、精细化工产品、传统化
工产品等也逐步的发展起来，并在有些领域替代了传统的工艺，显示出了巨大的潜力。
根据生物催化剂的制备和生物催化反应的关系，工业生物催化过程可分为两类：催化过
程与菌体生长耦联型，催化过程与菌体生长非耦联型。
2.1催化过程与菌体的生长耦联型
这类催化过程的特点是：菌体只有在具有生命活力的时候，才能起到催化作用。菌体生
长提供催化所需的催化剂，催化剂的制备和催化反应同时进行。催化的反应一般是由菌
体内多种酶耦合起来催化的串联反应。其中经常涉及到氧化还原状态的变化以及一些辅
酶的再生等, 催化过程中副产物较多，分离负担重。比较典型的催化过程如1,3-丙二醇、
VC、长链二元酸的生产等等。
2.1.1 1,3-丙二醇
1,3-丙二醇是一种重要的新兴化工原料，由1,3-丙二醇合成的聚酯如聚对苯二甲酸丙二
酯（PTT）等具有良好的性能和美好的工业化前景。欧美等国家正积极开展通过发酵法生
产1,3-丙二醇技术的研究。
在菌种上，肺炎杆菌属（Klebsiella pneumoniae）、丁酸梭状芽孢杆菌属（Clostridium
butyricum）以及在此基础上改造得到的基因工程菌都具有工业应用的价值[3,4]。美国的
DuPont公司和Genencor公司合作，开发以葡萄糖为底物经由甘油生产1,3-丙二醇，进一步
生产PTT树脂的技术[5]。该技术将K.pneumoniae中dha调节子基因克隆到大肠杆菌中，并
用此构建得到基因工程菌，以葡萄糖为底物发酵生产得到140-150g/L
1,3-丙二醇[6]。由甘油到1,3-丙二醇反应的过程中，一部分底物甘油通过还原途径，经
甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶催化，得到1,3-丙二醇；另一部分甘油通过氧化途
径供菌体生长需要，并提供还原所需要的NADH2。其催化过程需要与菌体生长耦合在一起
的多个酶协同作用，并且菌体在具有生物活性的时候，才能保证足够的还原当量和一些
辅酶的再生，最终保证催化反应顺利进行。如Hideki Kajiura [7]等在研究中发现，甘油
脱水酶经过一次催化后失活，需经过能量耦合的复活因子再生作用才能恢复活性。其过程
示意图如图1。
Fig. 1 Proposed mechanisms of reactivation of inactivated glycerol dehydratase
（E：glycerol dehydratase；RF：reactivating factor；Cbl：cobalamin；AdoH：5'-deoxyadenosine）
2.1.2 长链二元酸
长链二元酸（long chain dicarboxylic acid 简称DCA）是一类重要的精细化工原料，
用传统的化学法只能合成C12以下的二元酸。自80年代初日本矿业公司成功地开发出用发酵
法以石蜡烃为原料生产DCA后，化学法生产DCA13技术已完全被生物法所取代。
目前由生物法生产的DCA主要是直链α,ω-二羧酸，用于工业生产的菌种主要为Candida
tropicalis 的各种突变株。中国石油化工集团公司抚顺石油化工研究院通过诱变方法获
得一株高产DCA的Candida
tropicalis突变株（CCGMC356），在20t发酵罐生产DCA13培养120h产酸量达到153g/L，
烷烃分子转化率约53%左右，而且产物中未检测到DCA的降解物。近期研究表明，P450酶
和CPT酶在产酸过程中起到重要的作用，预计通过基因工程的方法对其改造，能显著地提
高有机酸的产量。在此过程中如何诱导酶活表达及稳定酶的催化能力至关重要[8]。
2.2 催化过程与菌体的生长非耦联型
这类催化过程的特点是：生物催化剂的制备与酶催化过程是在不同的体系中进行的，菌
体在生长时通过各种措施在菌体内积累高活力的酶，然后在反应器内进行单独催化，不
需要细胞再生长，该过程催化底物比较单一，催化反应也常为一步催化。如葡萄糖异构
酶、α-淀粉酶、腈水合酶、蛋白酶、脂肪酶等，底物的转化率较高，一般都在80％以上。
2.2.1．果葡糖浆
果葡糖浆是近20多年发展起来的新型甜味剂，它以淀粉为原料，通过α-淀粉酶和葡萄糖
糖化酶水解成葡萄糖后，再由葡萄糖异构酶进行异构化反应，制成一种含有果糖与葡萄
糖的混合糖浆。目前果葡糖浆已成为重要的甜味剂之一，其生产发展势头强劲。
1933年发现微生物或动物的糖代谢中，葡萄糖在转变为葡萄糖-6-磷酸酯后，经异构酶的
作用可转变为果糖-6-磷酸酯。1965年Tsumura、Takasaki等先后发现了适合于工业生产
的葡萄糖异构酶产生菌种--暗色链霉菌和白色链霉菌。1966年日本参松公司生产出酶法
异构糖浆。1974年，美国首
先应用固定化异构酶，大幅度降低了果葡糖浆的生产成本[9]。随着色谱分离技术的应
用，果葡糖浆的生产也逐步完善并推广开来。目前，发达国家生产果葡糖浆已采用三酶
法生产工艺，利用α-淀粉酶、葡萄糖糖化酶、葡萄糖异构酶直接从淀粉糖液生产果葡
糖浆，1998年，其产量已达2.3亿吨。葡萄糖异构酶的来源广泛，许多动植物和微生物
都可作为某些酶的原料；酶可以回收，重复利用。该过程中生物催化剂的制备与催化反
应在两个独立的系统中进行。
2.2.2 丙烯酰胺、丙烯酸等
腈水合酶类及腈水解酶是近年来研究比较多的酶，利用其催化生产酰胺、羧酸及其衍生
物，是一种非常有用的合成方法。这主要是因为此反应不仅条件温和，选择性好，而且
生物体如微生物细胞和植物细胞能将腈转化成光学活性酰胺或羧酸[10]，毋需酶的分离
纯化。生物法生产丙烯酰胺就是一个很好的例子。
丙烯酰胺是一种用途广泛的重要有机化工原料，以它为单体合成的产品不下百种，其中
聚丙烯酰胺的用途最为广泛。1985年起，日本首次采用微生物法商业化生产丙烯酰胺。
生物法以其转化率高(99%以上)、选择性好、成本低等优点迅速取代了传统的化学催化
水合法。而且酶法合成的丙烯
酰胺可以合成超高分子量聚丙烯酰胺。对于起催化作用的腈水合酶，在菌体里合成之
后，可在相当长的时间内保持活性，即使菌体停止生长后，酶仍具有催化作用。因此，
在生产工艺上既可以采用自由细胞进行催化，也可采用固定化酶催化。
丙烯酰胺的大规模工业生产推动了腈水合酶类研究热潮，Bhalla等人[11]用微生物
Rhodococcu. rhodochrous PA 34腈水解酶催化α-氨基腈不对称水解转化成光学活性氨
基酸。用不同微生物菌株的酶作用于各种不同的氨基腈，可以转化成一系列氨基酸，例
如Acinetobacter sp.所产的腈水解酶可将α-氨基丙腈转化成L-丙氨酸；Brevibacterium
sp. R312所产的腈水合酶作用于外消旋α-氨基腈可将其转化成光学活性L或D-氨基酸。
Crosby等[12]用Rhodococcu
sp.361腈水合酶催化一系列前手性3-羟基戊二腈的衍生物水解，转化成相应的光学活性
单氰基羧酸，获得较高光学纯度。
2.2.3 手性化合物研究
目前，手性化合物是国内外生物技术的主要产品。手性药物的不同对映体作用不同，从
疗效和安全性出发，单一对映体的分离和定性合成十分必要。如巴比妥药DMBB与MPPB左
旋(-)异构体均具有抗惊厥性，而右旋(+)异构体的功能则是促惊厥；镇静药"反应停"治
妊娠反应，(R)型为有效的镇
静剂，而(S)型异构体会造成短肢畸胎；非甾体消炎镇痛药萘普生(S)比(R)异构体强35倍，
布洛芬(S)比(R)强28倍等等。合成手性药物的生物转化反应可分为两类：一类是把外消
旋体拆分为两个光活性的对映体。另一类是从外消旋或手性前体出发，通过催化反应得
到不对称的光活性产物。
近期研究发现，当以外消旋化合物进行酶催化反应时，反应底物可以在反应的同时不断
的进行外消旋化，从而可以得到超过50％的对映体纯的异构体[13]。
手性化合物研究一个成功的例子是生物法半合成头孢菌素[2]。生物法生产利用了酶的对
映体催化专一性，只用两步就可以替代传统的化学法生产，从而减少了工艺流程，提高
了产量和纯度。D-氨基酸，L-氨基酸的拆分也引起了极大的关注。具有单一手性的氨基
酸在生理、药理以及一些工
业上都有重要的应用价值。Makoto Yagasaki[14]根据原料的不同，把酶法生产D-氨基
酸分为三类（见表1）。此外，一些氨基酸如L-丝氨酸[15] 、L-半胱氨酸[16]等，都
实现了用酶进行拆分的工艺流程。
Table 1 Enzymatic methods for the production of D-amino acids
Category Starting materials Enzymes or methods
DL-amino acids DL-amino acids Degradation of L-amino acids
N-acyl-DL-amino acids D-amino acylase
Synthetic intermediates DL-hydantoin D-hydantoin hydrolase and N-carbamoyl-D-amino acid hydrolase
DL-amino acid amides D-amidase
Prochiral substrates a-keto acids and L-amino acids D-transaminase and amino acid racemase
Kawai[17]等利用面包酵母中得到的硝基烯烃还原酶，不对称合成了含有三个顺序手性中
心的α-烷基b-羟基酯，这是一种重要的具有生物活性的三取代内脂的前体。在该酶的催
化作用下，b-酮基酯的α位被烷基取代，形成具有高度的立体选择性的b-羟基酯。他们
还从面包酵母中得到的硝基
烯还原酶I和II，并用这两种酶，还原了三代硝基烯，不对称合成了（2R,3S）-3-苯基-2
-硝基烷，得到的产品具有良好的立体选择性，比旋度可达98％。同时，他们利用放射性
标记对还原酶的作用机理进行了研究。在该酶还原作用下，从NAPDH上脱下的H将进入硝
基的b位，而从水或氨基酸中来的H则进入硝基的a位，从而得到具有高度立体选择性的产物。
2.3两种类型生物催化的区别和联系
表2列出了不同类型生物催化的一些区别和联系。现阶段，很多生物催化的研究，还处于
初期，一些催化的机理和过程还不清晰。对于生长耦联型生物催化，进行代谢流分析十
分必要。通过代谢流分析，找到关键酶，通过强化关键酶和阻断代谢旁路，将会显著提
高转化率和产物积累，加速
其工业化进程。对于生长非耦联型反应，可以把菌体的培养和催化过程分开进行，然后
在根据工艺的需要，采用游离细胞或采用纯酶作为催化剂。对于造价昂贵，需要重复利
用的酶，可以采用固定化酶技术增加其稳定性和耐受能力；也可采用先进的分离设备使
得酶（或菌体）和催化得到的产物分离。关于生物催化反应的能量变化过程、分子电子
转移过程等方面研究的不断深入，将会进一步揭示生物催化过程的本质。
Table2 Comparison of biocatalysis-coupled with cell growth and biocatalysis-uncoupled with cell growth
生长耦联型 非生长耦联型
反应过程 多步反应，底物通过多个反应得到产物 单步反应，底物通过简单反应得到产物
能量 需要生物体供能，如一些氧化还原酶系的反应，需要体内提供NADH2等供体 催化时不需要生物体供给能量
细胞生长 需要细胞生长 无需细胞生长
酶的类别 多为有氧化还原酶参加的多个酶 多为水解酶、异构酶类、裂合酶等
反应区域 酶需在菌体中实现催化作用 酶可分离，在菌体外仍然有催化活性
典型产品 1,3-PD，长链二元酸，青霉素，PHB,VC，天然香料等 丙烯酰胺，果葡糖浆，手性药物，DL-氨基酸的拆分，油脂改性，水解糖苷 [18]等
3. 工业生物催化剂的改性和提高研究
随着丙烯酰胺、长链二元酸等大宗产品逐渐走入市场，许多关于生物催化技术的探索研
究也广泛的开展起来，并在一些领域取得了可喜成果。但是，目前工业酶催化的生产过
程还是比较有限的，其主要原因在于：一是酶的品种少，二是目前酶的活性、耐温性、
耐酸碱变化等都是比较差的，
利用生物技术对现有的酶进行改性研究，提高酶的活性和耐久性，拓宽了工业生物催化
剂应用的领域，使得它更有工业应用的前景。近年来，这方面工作的研究主要集中在极
端菌的探索，非水相酶的研究，以及分子水平的定向进化、合理化设计等等。
3.1 极端菌研究
近年来，人们发现一些菌在高温、高盐浓度等条件下仍然可以生存。对这些极端菌进行
研究，有望逐步解决工业生物催化剂对温和环境依赖性等缺陷，从而提高酶在高温、高压
等条件下的催化活性，增加酶对底物和反应物抑制作用的抵抗程度，从而拓宽生物催化剂
使用的范围。极端菌包括
：喜高温菌、喜低温菌、喜盐菌、耐pH菌等。
现在已经筛选出30多属70多种的喜高温菌。通过对喜高温菌的结构分析得知，菌体在很多
方面表现出共价特性：具有高度非极性的核、表面积/体积比小、甘氨酸含量低、DNA高度
螺旋、链接单元--组织蛋白连接蛋白含量高等。喜盐菌多是从死海等咸水湖中分离出来，
菌种包括古细菌、细菌和真核生物等。一些盐杆菌的细胞浆液中积累K+，菌体中酸性氨基
酸含量远远高于碱性氨基酸含量。高阳离子浓度使得负离子远离蛋白质表面，有利于菌体
的稳定。这些结构上的特异性，使得这些菌种能够在极端的环境下生存[19]。
近期的研究集中在与工业生物催化相联系的极端酶的认定上。他们包括了酯酶/脂肪酶，
糖苷酶，缩醛酶，腈水解酶/酰胺酶，磷酸酯酶以及消旋酶。总的来说，喜高温菌主要应
用于食品工业和洗涤剂工业，喜低温菌有助于提高热敏性产品的产量，喜盐菌由于在高
盐浓度下稳定而被用于低含水体系的催化剂[20]。
3.2 非水相酶催化
80年代中期Klibanov等人[21]开创性的研究表明，许多酶在非水相中不仅不失活，而且
在某些情况下其活力与水相中相当，奠定了非水相酶学的基础。一些酶在不同的溶剂中
催化活力、选择性有较大的变化。这是因为在非水介质中，酶的空间结构会发生一定的
变化，而且酶与底物之间成键自由能也会发生变化。这就会使一些本来在水中不能和不
容易进行的反应可以在有机相中较容易的发生。
在酶催化合成的体系中，选择不同的反应介质，可以影响生成的聚合反应中聚合物的分
子量、聚合度分布、产量和构造。非水相酶促反应对一些传统化学催化困难的过程具有
重要的意义，另外，通过改变溶剂和相条件，可以得到不同空间结构和光学特性的聚合
物。
利用辣根过氧化酶（HRP）在非水相中合成芳烃聚合物是研究的比较广泛的一个过程[22]。
研究表明，在不同的介质中反应，这一过程将得到不同的结构和性质的聚合分子。在单
一和两相溶剂体系中，以HRP为催化剂，得到的芳烃的聚合物不具有特定的几何形状、
顺序和方向。但是，上述过程在反胶团体系中进行时，则可以得到微球颗粒，这种微
球状的聚合物颗粒，其粒径分布单一，大小依赖于水和表面活性剂的比例，一般为微米级
或者更低，这种微球可以用于酶、药物等的包封，也可作为半导体材料使用。如果催化过
程在水和空气的界面上进行，例如在Langmuir 槽中进行，则可以获得二维的单层网状膜
结构，这种网状结构的膜材料可以直接使用，而无需溶剂化。
对脂肪酶的一些研究，反应溶剂不仅影响反应速度，而且也影响产物的光学异构性。SvirKin
[23]等，利用脂肪酶催化开环聚合外消旋a-甲基-b-丙内酯，得到了具有光学活性S富集的
a-甲基-b-丙内酯聚合物。他们研究了不同有机溶剂的影响，在甲苯和庚烷中的聚合速率，
明显的大于其在二氧六环已烷中的聚合速率，而在甲苯和二氧杂环已烷中可以获得较
高的光学异构比，从这两方面看，甲苯是首选的溶剂。
尽管非水相体系有诸多优点，但是酶在有机相中由于分子间键能的变化，容易发生结构
重排而降解失活。为了提高酶活和使用寿命，可以采用化学修饰、表面改性、固定化等
多种方法，业已取得显著的成果。
3.3 分子定向进化
酶的改进方法中两个方法值得我们的注意，即合理设计与定向进化,
在合理设计中，基于对蛋白结构，功能和机制的详细了解，可以预先思考出氨基酸序列
精确的改变，然后通过定点突变的方法引入这些改变。其优点是能够优化所需的性质以
及极大地提高对于酶的结合与催化机制的认识。在已经成功的合理设计的例子中，通过
单个的氨基酸的替换或者是二
级结构设计产生了具有所需性质的酶。然而，由于对于提高所需的酶性质的内在机制的
不够完全的了解等原因，更多的实验都是失败的。而定向进化不需要关于酶结构与功能
关系的知识，这种技术采用一种随机的过程产生一个巨大的变异基因库，然后通过基因
选择或者高产量的筛选方法确定出具有性质改善的变异型。它在某种程度上仿真了自然
进化的过程。
总之合理设计是自上而下的方法，而定向进化是自下而上的方法，二者的比较如图2。目
前，我们对于蛋白质结构知识尚不足，尤其对二级结构了解较少的情况下，合理设计有
相当的困难，相比之下，定向进化虽然在选择方案的制定方面略显麻烦，但还是有许多
优点的。
Fig. 2 Schematics of rational design and directed revolution for proteins
定向进化技术的应用对改进酶制剂方面取得了令人瞩目的成就。Miyazaki K [24]对喜寒
菌的枯草杆菌蛋白酶进行3轮的定向进化，得到菌株3-2G7，它的蛋白酶在60℃的稳定性
比野生型菌体中的提高了500倍，甚至超过同源的喜高温菌的枯草杆菌蛋白酶。Wintrode
PL[25]等人从菌株3-2G7出发，再经过5轮的定向进化，使得稳定性提高到原野生型的
1200倍，而且比同源的喜高温菌高20倍。
Joo H.[26]等对Pseudomonas putida的P450酶进行了定向进化，得到了一个突变株，
它可以在缺少电子供体辅助因子的条件下使萘羟基化，比原始酶的活性提高了20倍。并且
此突变株还可以表达辣根过氧化酶，能把P450酶转化的产物转变成可发荧光的物质，从而
实现了筛选最佳突变株。
4. 工业生物催化的前景与发展策略
随着科研工作的进一步开展，以及各方面的努力，工业生物催化将在21世纪得到迅速的
发展，预期在二十年内，工业生物催化研究将有望实现以下突破：
1． 在与生物生长代谢相关的有机化学品生产上，取代化学法成为主流生产工艺
2． 开发出利用生物法生产的安全、环保、节能新产品，引导消费取向和潮流
3． 降低化学工业的原料消耗、水资源消耗、能量消耗30％，减少污染物的排放
和污染扩散30％
4． 对于生物催化剂体系，可以达到：研制出可以比现在应用的化学催化剂更好、更
快，价格更低廉的生物催化剂；提高生物催化剂的稳定性、活性和对溶剂的兼容能力；提
高酶以及固定化细胞的机械强度；对于转换时间比较长的酶，提高其转化的速度，使之可
以和现在的化学催化剂相比
尽管生物催化技术的前景非常广阔，但它的发展还受到现有生物技术发展水平和研究水平
的制约。目前已经定性的酶有3000多种，其中商品酶有200种左右，而工业上应用的酶仅
有50多种，至于大量工业生产的酶只有10多种，这说明酶工程仍然是一门年轻的学科，
既预示广阔的发展前景，也需要加强基础研究。
工业生物催化已经崭露头角，一方面，一些工业生物催化的典型的产品和工艺已经得到
推广应用；另一方面，世界知名化工公司DuPont、BASF、DSM、Lonza等，都已经致力于
工业生物催化的研究，并在一些脂类化合物、医药中间体、DL-氨基酸等方面实现了工
业规模生产[6,27]。
生物技术是一种没有污染的清洁的技术，是一种使用新原料、新能源的技
术。它的高速发展，将带来技术上的创新，也将推动生产力的高速发展。工业生物催化技
术的应用，将对生命科学研究产业化提供有力的例证，并将会对生物技术的大规模应用打
下更为坚实的基础，最终实现环境友好的、清洁的、可再生的生产。
生物催化技术的发展也将会带来丰厚的经济效益。并通过生物的高兼容性、手性产品等
新材料、新产品的开发和广泛应用，逐渐改变现有高能耗、高污染的生产结构和消费结
构。
正如上个世纪中期石油化工的飞速发展改变了人们的生产、生活方式一样，生物催化的
广泛应用，将会给人们提供性能更佳的材料和能源。以可再生的生物原料为基础的生物
生产过程，将逐步取代化石原料生产过程，成为21世纪化工生产的主体，从而实现绿色
化工、绿色生产的目标。
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