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各种研究报告了测序数据中的偏差如何导致外显子组和基因组测序的敏感性降低或假阳性变异。例如，对于NGS而言，高测序错误率和PCR重复将导致潜在的假阳性calls，而不均匀的序列覆盖或缺乏覆盖可能会导致灵敏度降低。其他问题，如strand偏倚和插入大小分布也可能对测序结果产生不利影响。NGS技术比传统的基因检测方法更加数据密集，需要信息技术（IT）和生物信息学方面的专业知识，而这在许多实验室最初是稀缺的。生物信息学已经解决了为测序数据建立严格质量控制的困难，但也解决了从测序数据中可靠识别变异的挑战。例如，检测插入和缺失、识别短片段扩增重复或低覆盖区域的变异或区分单核苷酸变异（SNV）与测序错误相对困难。

此外，从外显子组数据中检测拷贝数变异（CNV）已成为一种标准程序，并带来了自身特殊的挑战。同样，与测序仪器一样，生物信息学需要处理来自软件工具、基因Panel和其他注释资源的持续更新，以确保分子遗传学家拥有用于解释最新数据的最新信息。这反过来要求实验室实施自动测试其分析的策略以及重新分析现有数据的系统方法。
在新的测序可能性以及许多疾病的遗传和表型变异的推动下，临床基因检测在过去十年中发生了巨大的变化。根据临床表型，只有一个或几个基因会被测序；从靶向基因测试来看，现在通常涉及对大量疾病基因的分析。与单基因分析相比，外显子组或基因组测序中的大量变异的解释明显不同。这不仅需要对该技术有深入的了解，以便评估数据质量和已识别的变异，还需要新的变异解释方法。
  
NGS变异的初始报告有时过于严格，从而忽略了与患者表型不完全匹配的变异，或过于宽松，导致许多意义不确定的变异（VUS）。随着时间的推移，测序数据的质量有了很大的提高，并且开发具有不同变异频率的大型公共可用数据库，如GnomAD数据库，极大地帮助开发了更高效的变异筛选选项。此外，在过去的几年中，已经开发出各种建议和质量评估方案指导NGS变异的解释、分类和报告。
现在有一些关于NGS测试的指南可以帮助NGS测试设计、优化、验证、质量管理和生物信息学等方面。尽管如此，仍然存在许多挑战，错误肯定会发生，即使在质量至关重要的受监管临床基因检测实验室也是如此。这里我们展示了我们实验室在十年临床外显子组测序过程中犯下的一些错误的例子，以及我们从这些错误中吸取的教训（补充表S1）。虽然湿实验室有其特殊的挑战，但在这里，我们主要关注与数据分析和变异解释相关的问题。我们希望通过分享这些例子，其他实验室可以避免犯同样的错误。




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